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細(xì)胞株免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后,采用熒光標(biāo)記,標(biāo)記完成后,顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少。
從而做出一個定位研究,也可以為細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)提供一個明確的指導(dǎo),細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強(qiáng)、特異性高、速度快的特點(diǎn),是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù),也是比較準(zhǔn)確的。
一、實驗方法原理
在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中,需要用到細(xì)胞爬片,通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),細(xì)胞在爬片上生長,進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光。
二、實驗材料
1. 細(xì)胞樣品。
2. 試劑、試劑盒:多聚甲醛 70%甲醇 丙酮 PBS Triton BSA DAPI染液 DABCO Tris 甘油。
3. 儀器、耗材:玻片。
三、細(xì)胞株爬片免疫熒光實驗步驟
1. 在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每次3min。
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min, PBS浸洗玻片3次,每次3min。
3. 0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟)。
4. PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室溫封閉30min。
5. 吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜。
6. 加熒光二抗: PBST 浸洗爬片3次,每次3min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中20-37℃孵育1h,PBST浸洗切片3次,每次3min。注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行。
7. 復(fù)染核:滴加DAPI避光孵育5min,對標(biāo)本進(jìn)行染核,PBST 5minx4次洗去多余的DAPI。
8. 用吸水紙吸干爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。
注意事項
1.取細(xì)胞株爬片時,動作應(yīng)輕柔,防止將細(xì)胞爬片夾碎,影響實驗進(jìn)程。
2.種細(xì)胞過程中,要注意將細(xì)胞輕柔混勻,“八"字或者“十"字形搖晃,防止細(xì)胞局部生長過密。
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